Pengaruh Ekstrak Etanol Pegagan (Centella Asiatica) Pada Osifikasi Tulang Dan Osteoklastogenesis Pada Model Stunting Larva Zebrafish (Danio Rerio) Yang Diinduksi Rotenon
Daftar Isi:
- Stunting menurut WHO didasarkan pada indeks panjang badan / tinggi badan dibanding umur dengan batas nilai kurang dari -2 SD (Standart deviasi). Negara Indonesia menduduki peringkat kelima dunia untuk jumlah anak dengan kondisi stunting. Faktor yang mempengaruhi tumbuh kembang anak terdiri dari Faktor genetik dan lingkungan. Faktor lingkungan prenatal salah satunya adalah bahan toksik atau pestisida. Rotenon merupakan salah satu jenis pestisida yang memiliki aksi sebagai inhibitor komplek I mitokondria sehingga menyebabkan terhambatnya ATP (Adenine Tri Phosphate) dan peningkatan ROS (Reactive Oxygen Species). Dalam jaringan tulang ROS merupakan modulator kunci dari fungsi sel tulang. Stres oksidatif dapat menghambat pertumbuhan tulang dengan cara menghambat diferensiasi sel osteoblas melalui peningkatan osteoklastogenesis oleh peningkatan RANKL. Stres oksidatif dapat diturunkan dengan antioksidan. Pegagan merupakan salah satu tanaman yang memiliki kandungan antioksidan dan banyak tumbuh di Negara Indonesia. Bahan aktif antioksidan terbanyak dari Centella asiatica adalah titerpenoid yang terdiri dari madecassoside, asiaticoside, madecassid acid, dan asiatic acid. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan ekstrak etanol pegagan (Centella asiatica) dapat mencegah stunting pada larva zebrafish akibat induksi rotenon 12,5 ppb melalui osifikasi tulang dan osteoklastogenesis. Tujuan penelitian ini didasarkan pada penelitian terdahulu Ridlayanti, (2016) dan Wijayanti, (2016) yang membuktikan bahwa rotenon 10 ppb mampu menurunkan panjang badan larva zebrafish, namun hasil belum mencapai -2 SD. Pada penelitian ini dibuktikan bahwa rotenon 12,5 ppb secara optimum mampu untuk menciptakan larva zebrafish model stunting hingga mencapai -2SD. Metode penelitian ini adalah eksperimental menggunakan zebrafish yang diinduksi rotenon 12,5 ppb sejak 2-72 hpf. Ekstrak pegagan dalam memproteksi larva dari induksi rotenon 12,5 ppb menggunakan konsentrasi 1,25 μg/ml, 2,5 μg/ml dan 5 μg/ml yang dipapar bersamaan dengan rotenon 12,5 ppb. Software image raster 3 digunakan dalam pengamatan pertumbuhan pengukuran panjang badan larva zebrafish pada usia 3, 6 dan 9 dpf. Evaluasi osifikasi tulang pada larva zebrafish usia 9 dpf menggunakan pewarnaan alizarin-red secara wholemount. Warna merah yang muncul dikuantifikasikan menggunakan software image J melalui nilai integrated density dalam satuan pixel. Evaluasi Osteoklastogenesis dengan ekspresi RANKL pada larva zebrafish usia 9 dpf menggunakan wholemount imunohistokimia dengan pewarnaan DAB. Warna coklat yang muncul dikuantifikasikan menggunakan software image J melalui nilai integrated density dalam satuan pixel. Hasil penelitian menunjukkan, pada hari ke-3 tidak ada perbedaan rerata panjang badan pada semua kelompok. Pada usia 6 dpf (analog usia anak 2 tahun) dan 9 dpf (analog usia anak 8 tahun) menunjukkan panjang badan kelompok rotenon lebih pendek dibandingkan kelompok kontrol (nilai p-value = 0,000). Rasio panjang kepala dan panjang badan antar semua kelompok pada usia 3,6 dan 9 dpf memiliki rasio yang sama yaitu 1:5, sehingga dapat disimpulkan stunting terjadi sejak usia 6 dpf hingga 9 dpf. Pada kelompok rotenon+pegagan berbagai konsentrasi pada hari ke-3 juga tidak terdapat perbedaan rerata panjang badan yang signifikan. Kelompok rotenon+pegagan ix konsentrasi 2,5 μg/ml dan 5 μg/ml pada usia 6 dpf dan 9 dpf memiliki perbedaan yang signifikan dengan kelompok rotenon 12,5 ppb. Pengukuran osifikasi tulang pada usia 9 dpf menunjukkan penurunan osifikasi tulang pada larva zebrafish yang diinduksi rotenon. Osifikasi tulang meningkat pada ketiga kelompok rotenon+pegagan dengan efek maksimal dicapai pada konsentrasi 5 μg/ml (p = 0,001). Pengukuran ekspresi RANKL pada usia 9 dpf menunjukkan peningkatan ekspresi RANKL yang diinduksi rotenon. Ekspresi RANKL menurun pada kelompok rotenon+pegagan berbagai konsentrasi. Pemberian ekstrak pegagan mulai konsentrasi terendah (1,25 μg/ml) sudah dapat menurunkan ekspresi RANKL pada model stunting larva zebrafish yang diinduksi rotenon. Hasil penelitian menunjukkan bahwa induksi rotenon 12,5 ppb dapat menyebabkan model mild stunting pada larva zebrafish, hal ini terbukti dengan pengukuran panjang badan ikan pada usia 6 dan 9 dpf mencapai -2 SD dari rerata normal. Korelasi pearson antara konsentrasi pegagan dengan osifikasi tulang menunjukkan adanya hubungan positif (searah) dan kuat (0,755) artinya semakin tinggi konsentrasi pegagan yang diberikan maka dapat meningkatkan osifikasi tulang pada larva zebrafish yang diinduksi rotenon. Hal ini berkebalikan dengan korelasi antara konsentrasi pegagan dan ekspresi RANKL (-0,752) menunjukkan adanya hubungan negatif (berlawanan) dan kuat yang artinya semakin tinggi konsentrasi pegagan maka dapat menurunkan ekspresi RANKL. Hal yang serupa juga ditunjukkan pada korelasi antara panjang badan dengan Osifikasi tulang dan ekspresi RANKL. Korelasi antara Osifikasi tulang dan ekspresi RANKL juga menunjukkan hubungan yang negatif (berlawanan) dan kuat (-0,652) artinya Osifikasi tulang yang meningkat diikuti dengan penurunan ekspresi RANKL. Kesimpulan dalam penelitian ini adalah pemberian rotenon 12,5 ppb dapat menginduksi stunting pada larva zebrafish. Penambahan ekstrak etanol pegagan [2,5 μg/ml dan 5 μg/ml] dapat meningkatkan panjang badan larva zebrafish melalui peningkatan osifikasi tulang dan penurunan ekspresi RANKL.