Optimalisasi Metode Isolasi DNA dari Sampel Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) Pasien Triple Negative Breast Cancer untuk Next-Generation Sequencing
| Main Author: | Artha, Ayu Desi |
|---|---|
| Format: | Thesis NonPeerReviewed Book |
| Bahasa: | eng |
| Terbitan: |
, 2018
|
| Subjects: | |
| Online Access: |
http://repository.ub.ac.id/168786/1/Ayu%20Desi%20Artha%20%282%29.pdf http://repository.ub.ac.id/168786/ |
Daftar Isi:
- Rendahnya kualitas dan kuantitas DNA FFPE masih menjadi kendala dalam setiap analisis menggunakan Next-Generation Sequencing (NGS). Tujuan penelitian ini yaitu untuk menentukan jumlah input sampel FFPE, cara deparafinasi dan waktu inkubasi yang optimal menggunakan QIAamp DNA FFPE Kit dan GeneRead DNA FFPE Kit untuk mendapatkan isolat DNA FFPE yang sesuai dengan standar peruntukan NGS. Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan (Februari – Juli 2018) di Laboratorium Stem Cell and Cancer Institute (SCI), Kalbe Farma Tbk., Jakarta Timur. Sampel FFPE berasal dari arsip pasien kanker payudara RS. Dharma Nugraha dan telah disetujui oleh komite etik SCI. Perlakuan yang diberikan meliputi jumlah input sampel 3 x 10 μm dan 6 x 10 μm, metode deparafinasi di slide glass dan microtube, dan variasi waktu inkubasi dalam Proteinase-K pada suhu 56 oC selama 1 jam, 4 jam, dan 16 jam. Parameter yang diukur dalam penelitian ini adalah konsentrasi dsDNA dengan target sebesar 25 ng/μL, diukur dengan Qubit Fluorometer. Integritas DNA diuji dengan quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) menggunakan SYBR Green I dyes, sampel dengan nilai kuantifikasi (ΔCq) ≤ 2 dapat digunakan untuk proses library preparation untuk NGS. DNA diamplifikasi menggunakan AFP2 custom amplicon design yang ditujukan untuk BRCA1/2 germline assay. Produk PCR dengan ukuran ~350 bp menunjukkan kualitas DNA yang baik untuk disekuensing. Hasil penelitian menunjukkan bila jumlah input sampel FFPE sebanyak 6 x 10 μm, metode deparafinasi di slide glass, dan waktu inkubasi 4 jam dalam Proteinase-K pada suhu 56oC merupakan kondisi optimum untuk mendapatkan isolat DNA yang dibutuhkan untuk NGS. Kapabilitas Kit QA dan Kit GR untuk isolasi DNA tidak berbeda signifikan.