ISOLASI PROMOTOR GEN PENGKODE HORMON PERTUMBUHAN (GH) IKAN GURAMI (Osphyronemus gourami lac.)
| Main Author: | Hasbiyan Rosyadi dkk |
|---|---|
| Format: | PeerReviewed eJournal |
| Bahasa: | ind |
| Terbitan: |
PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA UM
, 2009
|
| Online Access: |
http://karya-ilmiah.um.ac.id/index.php/pkm/article/view/2114 |
Daftar Isi:
- RINGKASAN PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA ISOLASI PROMOTOR GEN PENGKODE HORMON PERTUMBUHAN (GH) IKAN GURAMI (Osphyronemus gourami lac.) BIDANG KEGIATAN : PKMP Oleh: Hasbiyan Rosyadi NIM 303342466479 Angkatan 2003 Andi Asrudin NIM 303342466492 Angkatan 2003 Binti Zariatin NIM 305342479129 Angkatan 2005 Nuning Winaris NIM 405342480134 Angkatan 2005 Primadya Anantyarta NIM 405342456158 Angkatan 2005 UNIVERSITAS NEGERI MALANG TAHUN 2008 ISOLASI PROMOTOR GEN PENGKODE HORMON PERTUMBUHAN (GH) IKAN GURAMI (Osphyronemus gourami lac.) Hasbiyan Rosyadi, Andi Asrudin, Binti Zariatin, Nuning Winaris dan Primadya Anantyarta Jurusan Biologi, Fakutas MIPA, Universitas Negeri Malang, Malang ABSTRAK Ikan gurami (Osphyronemus gourami) merupakan salah satu ikan yang memiliki tingkat konsumsi tinggi. Permintaan pasar yang tinggi dari tahun ke tahun menyebabkan para petani ikan gurami harus mampu meningkatkan hasil produksinya (Anonim2, tanpa tahun). Namun, pertumbuhan ikan gurami relatif lebih lambat dari pada spesies ikan air tawar lainnya. Menurut Kartikaningsih (2001) salah satu hal yang mempengaruhi lambatnya pertumbuhan ikan gurami ini adalah pada kondisi internal ikan (faktor genetik) sehubungan dengan kemampuan ikan dalam mencerna dan memanfaatkan sumber energi dari pakan sebagai deposit dalam bentuk pertambahan berat tubuh. Melalui teknologi transgenik, permasalahan lambatnya pertumbuhan ikan seperti gurami mendapat sedikit titik terang. Penerapan transgenik yang dimaksud adalah bagaimana meningkatkan pertumbuhan ikan gurami melalui modifikasi genetik dengan perbanyakan gen pertumbuhan atau promotor gen tersebut melalui transfer gen pertumbuhan baik yang berasal ikan lain maupun dari ikan gurami itu sendiri. Saat ini sedang dilakukan penelitian tentang isolasi gen pengkode hormon pertumbuhan pada ikan gurami di Institut Pertanian Bogor (IPB). Oleh karena itulah perlu dilakukannya isolasi promotor gen GH dari ikan gurami. Pada penelitian ini metode yang digunakan adalah metode deskriptif eksploratif untuk mencari sekuen promotor gen pengkode GH ikan gurami dengan acuan gen promotor metallothionein (MT-B) dari ikan Sockeye. Penelitian ini dilakukan beberapa tahap yaitu : 1. Isolasi DNA total 2. Pemotongan dengan enzim restriksi, adapun enzim retriksi yang digunakan adalah BamHl, Ball, Sfil, Sbal, dan EcoRl. 3. Elektroforesis 4. Isolasi pita (band) DNA dari gel elektroforesis Sampai hasil penelitian ini ditulis, hasil didapat adalah isolat DNA total ikan gurami. Sedangkan promotor belum dapat ditentukan. Hal ini disebabkan terlambatnya enzim retriksi yang telah dipesan sehingga pemotongan dengan enzim reriksi belum terlaksana. PENDAHULUAN Dalam perkembangannya, biologi molekuler kini telah diterapkan dalam budidaya perikanan. Beberapa permasalahan perikanan terutama dalam budidaya ikan dapat teratasi dengan bioteknologi molekuler, salah satu teknologi tersebut adalah teknologi transgenik. Transgenik atau teknologi DNA rekombinan (rDNA) merupakan rekayasa genetik yang memungkinkan kombinasi ulang (rekombinasi) atau penggabungan ulang gen dari sumber yang berbeda secara in vitro (karim, 2002). Sedangkan transgenesis adalah proses bioteknologi modern dimana sifat-sifat dari suatu mahluk hidup dirubah dengan cara memindahkan gen-gen dari satu spesies mahluk hidup ke spesies yang lain, ataupun memodifikasi gen-gen dalam satu spesies. Organisme yang direkayasa secara genetika disebut Genetically Modified Organism (GMO), atau disebut transgenik. Di dalam Pedoman Pelaksanaan Pengujian Keamanan Hayati Produk Bioteknologi Pertanian Hasil Rekayasa Genetik Seri Ikan Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Departemen Pertanian dijelaskan bahwa teknologi transgenik ini dicoba terhadap berbagai spesies ikan budidaya dengan tujuan utama untuk peningkatan kualitas ikan budidaya. Selain itu transgenik dilakukan untuk mendapatkan sifat yang diinginkan dan peningkatan produksi. Meskipun teknologi transgenik ini memungkinkan untuk diaplikasikan dalam bidang akuakultur (budidaya perikanan), namun masih perlu dilakukan penelaahan khusus untuk mengetahui teknologi tersebut. Ikan gurami (Osphyronemus gourami) merupakan salah satu ikan yang memiliki tingkat konsumsi tinggi. Permintaan pasar yang tinggi dari tahun ke tahun menyebabkan para petani ikan gurami harus mampu meningkatkan hasil produksinya (Anonim2, tanpa tahun). Namun, pertumbuhan ikan gurami relatif lebih lambat dari pada spesies ikan air tawar lainnya. Untuk mencapai bobot konsumsi (sekitar 700 g) memerlukan waktu sekitar 3 tahun. Umur ikan dapat mencapai 10 tahun. Menurut Kartikaningsih (2001) lambatnya pertumbuhan ikan gurami ini diduga disebabkan oleh dua fakor dominan, yaitu : 1. Kondisi internal ikan (faktor genetik) sehubungan dengan kemampuan ikan dalam mencerna dan memanfaatkan sumber energi dari pakan sebagai deposit dalam bentuk pertambahan berat tubuh. 2. Kondisi eksternal dari pakan, formulasi pakan belum mengandung sumber nutrien yang lengkap bagi ikan sehingga tidak bisa memacu pertumbuhan pada titik optimal. Pertumbuhan ikan secara umum dikontrol oleh hormon yang disebut Growth Hormone (GH), untuk membuktikan hipotesis tersebut telah dilakukan berbagai penelitian dengan penerapan berbagai cara agar GH dapat disekresikan sehingga kadar GH daram darah dapat ditingkatkan atau dapat dihambat, dengan efek, apabila GH dirangsang kadarnya di dalam darah akan meningkat dan dapat meningkatkan pertumbuhan, dan sebaliknya apabila GH dihambat maka pertumbuhannya akan menurun (Basuki, 2001). Dalam proses pertumbuhan hormon ini berperan meningkatkan transportasi asam amino ke dalam sel dan juga meningkatkan sintesis protein melalui mekanisme yang terpisah dari efek pengangkutan (Granner, 1997). GH merupakan polipeptida tunggal dengan massa molekul sekitar 22 kDa pada semua jenis mamalia (Granner, 1997). Sintesis GH dalam sel diatur oleh gen pengkode GH. Gen ini memegang peranan penting dalam keberadaan GH. Pada beberapa ikan transgenik, perbanyakan gen pengkode GH melalui transfer gen mampu meningkatkan GH dalam darah dan mampu meningkatkan pertumbuhan ikan tersebut. Pada tahun 1985 dan 1986, Zhu et al. melaporkan bahwa telah mampu memproduksi ikan transgenik dengan mentransfer gen pertumbuhan. Mereka telah berhasil membuat ikan loach, goldfish dan ikan mas transgenik dengan menggunakan promotor metallothionein tikus yang diligasikan dengan struktur gen GH dari manusia. Ikan transgenik ternyata 3 kali lebih besar dari ikan kontrol. Sejak saat itu, beberapa laporan penggunaan konstruksi gen yang serupa telah dipublikasikan (Rokkones, 1989; Guyomarde, 1989; Chen, 1990 dalam Hew, 1996). Pada proses transkripsi, suatu gen memerlukan adanya promotor sebagai inisiator proses transkripsi. Promotor merupakan beberapa pasang basa nukleutida yang berperan dalam mengenali protein yang disebut faktor transkripsi. Faktor transkripsi ini berikatan dengan sekuen promotor dan mengambil RNA polimerase (Anonim3, 2007). Melalui teknologi transgenik, permasalahan lambatnya pertumbuhan ikan seperti gurami mendapat sedikit titik terang. Penerapan transgenik yang dimaksud adalah bagaimana meningkatkan pertumbuhan ikan gurami melalui modifikasi genetik dengan perbanyakan gen pertumbuhan atau promotor gen tersebut melalui transfer gen pertumbuhan baik yang berasal ikan lain maupun dari ikan gurami itu sendiri. Saat ini sedang dilakukan penelitian tentang isolasi gen pengkode hormon pertumbuhan pada ikan gurami di Institut Pertanian Bogor (IPB). Oleh karena itulah perlu dilakukannya isolasi promotor gen GH dari ikan gurami. METODE PENELITIAN Pada penelitian ini metode yang digunakan adalah metode deskriptif eksploratif untuk mencari sekuen promotor gen pengkode GH ikan gurami dengan acuan gen promotor metallothionein (MT-B) dari ikan Sockeye. Penelitian ini dilakukan beberapa tahap yaitu : 5. Isolasi DNA total 6. Pemotongan dengan enzim restriksi, adapun enzim retriksi yang digunakan adalah BamHl, Ball, Sfil, Sbal, dan EcoRl. 7. Elektroforesis, 8. Isolasi pita (band) DNA dari gel elektroforesis Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Hewan Jurusan Biologi Universitas Negeri Malang, pada bulan Maret 2008 hingga bulan Juli 2008. Objek penelitian ini adalah ikan gurami (Osphyronemus gourami) yang di dapat dari Pembenih ikan gurami di Desa Popoh Kecamatan Wlingi, Kabupaten Blitar. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : sentrifuge, collection tube, high filter tube, microwave oven, tabung evendorf, mikropipet, vortex mixer, cawan petri, skapel, beaker glass, mesin elektroporesis. Sedangkan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: a. Isolasi dan Purifikasi DNA 1) Tissue Lysis Buffer 2) Proteinase K 3) Binding Buffer 4) Inhibitor Removal Buffer 5) Wash Buffer 6) Ellution Buffer 7) Et-OH (Alkohol 70%) dingin 8) Isopropanol Keterangan : (bahan 1-6 tersedia dalam High Pure PCR Template Preparation Kit) b. Elektroforesis 1) TBE 2) Buffer elektroforesis 3) Ethidium bromide 4) Bromophenol blue 5) Agarose 6) Aquades 7) EDTA (etilen diamin tetra asetat) 8) Et-OH (Alkohol 70%) Prosedur Kerja 1. Isolasi Promotor Gen GH ikan Gurami a) Isolasi dan Purifikasi DNA Total 1) Sampel dari jaringan ikan ditimbang sebanyak 25-50 mg lalu dicacah menggunakan skapel, kemudian dimasukkan ke dalam tabung evendorf ukuran 2 ml. 2) 200 μl Tissue Lysis Buffer dan 40 μl Proteinase K ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel jaringan, kemudian dicampur dengan segera dan diinkubasi pada suhu 55 oC selama 1 jam (atau sampai jaringan hancur dengan sempurna). 3) 200 μl Binding Buffer ditambahkan lagi ke dalam tabung lalu dihomogenkan dengan segera, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70 oC. 4) 100 μl Isopropanol ditambahkan ke dalam tabung, kemudian dihomogenkan. 5) Memindahkan sampel ke dalam high filter tube yang telah dipasangkan dengan collection tube. 6) Sampel disentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 9200 rpm. 7) Membuang collection tube, menambahkan 500 μl Inhibitor Removal Buffer, kemudian disentrifuge selama 1 menit pada kecepatan 9200 rpm. 8) Membuang collection tube, menambahkan 500 μl Wash Buffer, kemudian disentrifuge selama 1 menit pada kecepatan 9200 rpm. 9) Membuang collection tube, menambahkan 500 μl Wash Buffer, kemudian disentrifuge selama 1 menit pada kecepatan 9200 rpm. 10) Membuang supernatan dari collection tube, kemudian disentrifuge selama 10 detik dengan kecepatan 14.000 rpm. 11) Membuang collection tube, memasangkan tabung evendorf baru pada high filter tube. 12) 200 μl Elution Buffer (yang telah diinkubasi hingga suhu 70 oC) ditambahkan ke dalam high filter tube, kemudian disentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 9200 rpm. 13) Membuang high filter tube, menambahkan 140 μl Isopropanol, kemudian disentrifuge selama 30 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. 14) Membuang supernatan, menambahkan 66,7 μl Et-OH (Alkohol 70%) dingin, kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. 15) Membuang supernatan (pelet tidak boleh ikut terbuang), kemudian diangin-anginkan hingga pelet mengering (kurang lebih selama 12 jam). 16) 20 μl TE ditambahkan ke dalam tabung, dan DNA total siap diproses lebih lanjut. b) Isolasi Promotor. 1) Mencari sekuen promoter region gen pengkode GH ikan jenis lain yang telah dilaporkan sebelumnya pada gene bank (NCBI). 2) Mencari dan menentukan enzim restriksi yang sesuai untuk memotong promoter region gen pengkode GH ikan gurami. 3) Enzim yang ditentukan untuk memotong promoter region gen pengkode GH ikan gurami adalah BamHl, Ball, Sfil, Sbal, dan EcoRl. 4) Setelah diketahui enzim restriksi yang sesuai kemudian dilakukan pemesanan kepada SIGMA Singapura. 5) Dilakukan pemotongan promoter region gen pengkode GH ikan gurami dengan enzim restriksi yang telah dipesan. 6) Hasil dari pemotongan dengan enzim restriksi kemudian dielektroforesis dan dibandingkan berat molekulnya dengan DNA marker. 7) Pita (band) yang sesuai dengan DNA marker untuk promotor gen pengkode GH dipisahkan dengan cara memotong gel yang berisi band tersebut kemudian diisolasi dari gel dengan menggunakan DNA elution kit. 8) Diperoleh suspect DNA promotor gen pengkode GH dari ikan gurami. HASIL DAN PEMBAHASAN Sejauh ini data yang berhasil diperoleh adalah isolat DNA total. Isolat DNA total tersebut merupakan hasil isolasi dan purifikasi DNA dari jaringan (otot) ikan gurami. Selanjutnya hasil isolat DNA total tersebut perlu dipotong dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi yang diperlukan untuk memotong DNA total tersebut adalah BamHl, Ball, Sfil, Sbal, dan EcoRl. Setelah dipotong dengan menggunakan enzim restriksi hasil pemotongan DNA total perlu dielektroforesis untuk mendapatkan pita (band) DNA yang sesuai dengan DNA marker. Pita (band) DNA yang berat molekulnya sesuai ataupun mendekati berat molekul DNA marker ditentukan sebagai suspect DNA. Suspect DNA merupakan fragmen DNA yang diduga sebagai promoter gen pengkode GH (promoter metallothionein B/MT-B) pada ikan gurami. Namun proses pemotongan dengan enzim restriksi belum dapat dilakukan akibat kendala dalam memperoleh enzim restriksi. Enzim restriksi diperoleh dengan cara memesan dari Singapura (melalui agen resmi). Hingga laporan ini disusun, enzim restriksi yang dipesan belum kami peroleh. Perkiraan kedatangan enzim tersebut adalah sekitar akhir bulan Juni atau awal bulan Juli. Proses elektroforesis tidak dapat dilakukan sebelum pemotongan DNA total berhasil dilaksanakan. Sehingga belum diperoleh data yang diharapkan, yaitu berupa suspect DNA promotor gen pengkode GH yang dapat dianalisis dan dibahas secara deskriptif. Sequencing dan alligment (dengan promotor MT-B ikan sockeye yang telah berhasil ditemukan) diperlukan untuk memperoleh kepastian bahwa suspect DNA yang berhasil diperoleh benar-benar merupakan promotor gen pengkode GH (promoter MT-B). Namun dibutuhkan waktu yang lama dan dana yang jauh lebih besar untuk melakukan sequencing dan alligment. Sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan sekuen promotor gen pengkode GH (promotor MT-B) dari ikan gurami. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan sebagai berikut: 1. Promoter gen pengkode hormon pertumbuhan belum berhasil diisolasi akibat terlambatnya enzim retriksi yang telah dipesan. 2. Sejauh ini data yang berhasil diperoleh adalah DNA library. 3. Penelitian ini akan dilanjutkan jika peneliti menerima enzim retriksi yang telah dipesan. DAFTAR PUSTAKA Anonim1. Tanpa tahun. Pembenihan Ikan Gurami. (online). (http://bbat-sukabumi.tripod.com/gurami.html diakses 20 September 2006) Anonim2. Tanpa tahun. Budidaya Pendederan dan Pembesaran Ikan Gurami. (online). (http://www.bi.go.id/sipuk/lm/ind/ikan_gurami/htm diakses 20 September 2006). Anonim3. 2007. Promoter. (online). http://en.wikipedia.org/wiki/Promoter. Anonim4. 1998. Pedoman Pelaksanaan pengujian keamanan hayati produk Bioteknologi pertanian hasil rekayasa genetic Seri ikan Badan penelitian dan pengembangan pertanian Departemen pertanian. (online). http://bchindonesia.org/docs/petunjuk03_ikan.pdf. Basuki, Fajar. 2001. Tinjauan Falsafah Ilmu Terhadap Transgenik Ikan. Makalah Falsafah Sains. Institut Pertanian Bogor. Devllin, Robert, H. 1994. Transgenic fish and vectors therefor. (online). http://www.patentstrom.com diakses pada 06 Mei 2008. Gardner, E. John; Simmons, J. Michael; Snustad, Peter D. 1991. Principle of Genetic. Singapore. John Wiley & Sons. Inc. Granner, Daryl; Murry, Robert; Mayes, Peter; Rodwell, Victor. 1997. Hormon Hipofise dan Hipothalamus dalam Biokimia Harper. Edisi 24. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Greenspan, Francis; Baxter, John. 1998. Endokrinologi Dasar dan Klinik. Jakarta. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Hiroshi, Kawauchi; Kazuo, Yamaguchi; Kunikatsu, Shirahata. 1987. Fish Growth hormone. http://www.freepatentsonline.com/4645755.html. (online) Hew, Choy;. Fletcher, Garth L. 1996. Transgenic salmonid fish expressing exogenous salmonid growth hormone. (online). http://www.patentstorm.us/patents/5545808-fulltext.html. Kartikaningsih, H; Suryanti, Y; Subagyo; Hariati, A.M; Wiadnya, D.G.R. 2001. Peranan Chitin dari Limbah Pengolahan Udang sebagai Pemacu Pertumbuhan Ikan Gurami (Ospheronemous gouramy, Lac.). Jurnal Ilmu-ilmu Hayati (Life Science) vol. 13 - No. 1. Juni 2001. Karim, Yusri M. 2002. Upaya Peningkatan Produksi Akuakultur melalui Aplikasi Teknologi Transgenik. Makalah Falsafah Sains. Institut Pertanian Bogor. L, Galli. 2000. Genetic modification in aquaculture. (online). Moyle, Peter B; Cech, Joseph J, Jr. 2000. Fishes; An Introduction to Ichthyology, Fourth. Edition. Singapore. Prentice Hall Pte. Ltd. Peter, R.E. and T.A. Marchant., 1995. The endocrinology of groth in carp and releted species. Aquaculture 129 Reynold, et al. 2001. Tilapia Chromosomal Growth Hormone Gene Expression Accelerates Growth in Transgenic Zebrafish (Danio Rerio). EJB Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458 Vol.4 No. 2, Issue of August 15, 2001. (online). http://www.ejbiotechnology.info/content/vol4/issue2/full/3/index.html Sigma. 2006-2007. Biochemicals and Reagents for Life Science Reasearch.. Singapore.