KLONING DAN EKSPRESI DAERAH DBL3x dan DBL5Îμ GEN var2csa Plasmodium falciparum PADA Escherichia coli BL21 (DE3)
| Main Authors: | , Sapto Nugroho Hadi, , Prof. Dr. Mustofa, Apt., M.Kes. |
|---|---|
| Format: | Thesis NonPeerReviewed |
| Terbitan: |
[Yogyakarta] : Universitas Gadjah Mada
, 2011
|
| Subjects: | |
| Online Access: |
https://repository.ugm.ac.id/97262/ http://etd.ugm.ac.id/index.php?mod=penelitian_detail&sub=PenelitianDetail&act=view&typ=html&buku_id=52554 |
Daftar Isi:
- Penyakit malaria disebabkan oleh parasit Protozoa galur Plasmodium. Plasmodium falciparum adalah spesies paling berbahaya di antara empat spesies lain yang menginfeksi manusia. Infeksi oleh P. falciparum dapat menyebabkan kematian. Tahun 2009, penderita malaria di dunia diduga mencapai 225 juta dengan kasus kematian akibat malaria diduga mencapai 781.000 jiwa. Populasi berisiko tinggi terinfeksi malaria adalah wanita hamil. Plasmodium falciparum mengekspresikan P. falciparum erythrocyte membrane protein-1 (PfEMP-1) pada permukaan eritrosit terinfeksi. Protein ini memediasi perlekatan eritrosit terinfeksi ke sel endotelial inang, menginduksi respon kekebalan yang berkaitan dengan perlindungan terhadap infeksi malaria. Salah satu anggota PfEMP-1 adalah VAR2CSA. Protein VAR2CSA memiliki kemampuan untuk memediasi perlekatan parasit kepada plasenta melalui reseptor chondroitin sulfate A (CSA) yang terdapat pada permukaan plasenta. Penelitian yang bertujuan untuk menghasilkan vaksin yang menargetkan molekul ini menjadi penting dalam pengembangan agen yang dapat menghalangi perlekatan parasit pada plasenta. Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning dan mengekspresikan dua daerah gen var2csa yang mengkode VAR2CSA, yaitu daerah DBL3x dan DBL5Îμ pada Escherichia coli BL21 (DE3). Protein fusi rekombinan akan digunakan sebagai langkah awal untuk pengembangan vaksin berbasis anti-perlekatan untuk wanita hamil. Pada penelitian ini, daerah DBL3x dan DBL5Îμ gen var2csa P. falciparum galur 3D7 diamplifikasi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang dirancang spesifik berhasil mengamplifikasi daerah DBL3x (948 bp) and DBL5Îμ (729 bp). Produk amplifikasi yang diperoleh berhasil dikloning ke dalam PCR ® 2.1-TOPO ® dan diperbanyak di dalam sel inang bakteri E. coli galur TOP10. Hasil sekuensing daerah DBL3x and DBL5Îμ telah dikonfirmasi memiliki kedekatan mencapai 99% dengan data yang telah dipublikasikan. Situs restriksi NcoI dan XhoI berhasil diintroduksi menggunakan PCR ke dalam sekuen DBL3x dan DBL5Îμ untuk memungkinkan proses ligasi ke dalam vektor ekspresi pET28a (+). Konstruk ekspresi yang berhasil diperoleh berhasil dikloning ke dalam sel inang E. coli BL21 (DE3). Protein rekombinan hasil ekspresi berhasil divisualisasi dengan SDS-PAGE. Ukuran protein yang diekspresi adalah 38 kDa dan 28 kDa untuk DBL3x dan DBL5Îμ, secara berturut-turut. Peningkatan jumlah protein rekombinan yang diekspresikan dapat dideteksi sebagai kultur bakteri yang diinduksi pasca penambahan IPTG 1mM selama 4 jam yang dibandingkan dengan kontrol non induksi.